在做新藥研發(fā)時(shí)，沒(méi)有對應的中藥標準品，根據需要自制了標準品，可是關(guān)于標化的問(wèn)題一直弄不太明白。一直認為應該是我用各種能用到的方法來(lái)測定它的含量，然后取一下平均值就可以了。原本是打算用非水滴定，HPLC(UV檢測器)，HPLC(蒸發(fā)光檢測器)三種方法來(lái)確定一下含量的?？墒亲蛱炫龅搅艘粋€(gè)前輩，他說(shuō)這么做是錯誤的，應該用HPLC的幾種檢測器都來(lái)做一下，然后從中選出結果最好的那個(gè)，比如說(shuō)是UV檢測器，然后用同一個(gè)流動(dòng)相，同一根柱子，一個(gè)波長(cháng)，分別在三臺不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的HPLC儀上測定，再取其平均值才是標準品的含量。有這種說(shuō)法嗎?
個(gè)人覺(jué)得那我還不如用兩個(gè)不同的流動(dòng)相在同一臺機器上測定，然后取其平均值呢?
兩個(gè)方法我覺(jué)得都不妥，你用HPLC測定標準品的含量，那么用什么做對照呢?這是外標法的問(wèn)題;如果你用內標法，那么內標怎么選?是不是合適呢?專(zhuān)家也會(huì )提出這樣的問(wèn)題;那么你會(huì )說(shuō)用歸一化法，可是這個(gè)方法本來(lái)就存在著(zhù)條件摸索的問(wèn)題，你采用的液相條件能確定把所有的雜質(zhì)給分離嗎?所以現在化藥一般決不會(huì )用歸一化法來(lái)測含量的。
所以推薦采用非水滴定法，只要你確定標準滴定液濃度正確，滴定方法得當，專(zhuān)家不會(huì )提出太大問(wèn)題。我們以前沒(méi)有標準品時(shí)都會(huì )用滴定法確定標準品的含量，全部都通過(guò)?！ ?/span>
我想原因應該是使用HPLC(UV檢測器)，對一個(gè)新藥建立含量測定方法，本身這個(gè)條件就是在不斷的摸索過(guò)程中建立起來(lái)的。你不能說(shuō)你建立的這個(gè)方法是最好的，只不過(guò)是這個(gè)方法滿(mǎn)足了各方面的要求，這個(gè)方法你可以使用而已?？隙☉撨€存在著(zhù)和你這個(gè)條件更好或者是差不多一樣的條件。就拿我這個(gè)藥來(lái)說(shuō)吧，我就找到了兩個(gè)都不錯的條件，緩沖鹽不一樣，PH值也不一樣，但效果都不錯，后來(lái)我就選了理論塔板數稍高一點(diǎn)的那個(gè)條件。
對于標準品的標化，用HPLC的話(huà)只能用面積歸一化法了，我個(gè)人覺(jué)得用不同的條件出的峰肯定會(huì )略有差別的，我用兩個(gè)不同的條件分別來(lái)測定，這樣可以增大可靠性。這就有點(diǎn)像從中草藥中提取分離單體化合物一樣(不知道你在中草藥提取分離方面怎么樣?)，一般在分離中草藥中的單體化合物時(shí)，當你懷疑用一個(gè)展開(kāi)劑跑出來(lái)的點(diǎn)是個(gè)單體的話(huà)，一般你還需要換1-2種完全不同的展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，或者要把硅膠換成聚酰胺或葡聚糖凝膠什么的。如果在變換了各種條件仍然是一個(gè)點(diǎn)，那基本就可以確定是個(gè)單體化合物了，然后再去打譜確定結構。
對非水滴定法的說(shuō)法比較贊成。首先要確定你的標準品的含量，至少應該做正相，反相，DAD檢測。至于不同儀器，不同實(shí)驗室間的測試是另外一回事?！ ∫话銇?lái)講，用HPLC法來(lái)測定含量，是需要有對照品的，不管外標法、內標法都需要。而你做的是一類(lèi)新藥，肯定沒(méi)有對照品。所以，我同意 cyl003135 的說(shuō)法，需要有一個(gè)方法，作方法學(xué)研究。但肯定不能是HPLC法?？梢杂梅撬味ǚ?，用電位指示終點(diǎn)。作出滴定曲線(xiàn)。如果有合適的指示劑，可以比較一下，如果滴定終點(diǎn)電位與指示劑變色終點(diǎn)能夠統一，也可用指示劑指示終點(diǎn)。但仍要做線(xiàn)性、精密度、穩定性、回收率等資料。必要時(shí)，需要作影響因素、加速、長(cháng)期試驗考察對照品的穩定性。
今天就我的這個(gè)問(wèn)題去咨詢(xún)了我們省藥檢所化藥室的主任,她是這樣回答的：
1、要用兩個(gè)不同的方法來(lái)標化。比如說(shuō)我這個(gè)原料藥就可以采用非水滴定(容量分析法)和HPLC法(儀器分析法)。2、HPLC法必須采用兩個(gè)完全不同的條件來(lái)分別測定，用面積歸一化法來(lái)計算就可以了。
所謂不同的條件包括：
?、磐耆煌牧鲃?dòng)相(比如說(shuō)我這個(gè)項目，目前我已經(jīng)摸索到了兩個(gè)不同的條件，雖然都是用的乙睛-水系統，但緩沖鹽和PH值分別都是不同的，所以就可以使用這兩個(gè)條件了。)
?、撇煌放频纳V柱(就是換根柱子，至于國產(chǎn)還是進(jìn)口的倒是無(wú)所謂)
?、遣煌放频腍PLC色譜儀(如果條件實(shí)在不允許，在同一臺儀器上用不同的流動(dòng)相和不同的色譜柱進(jìn)行測定也可以)
3、取三個(gè)方法含量的平均值就可以了。(我現在已經(jīng)用非水和一種HPLC條件測定過(guò)了，基本含量差距不大，如果差距很大，那就取含量低的那個(gè)方法的平均值)
4、HPLC法測定含量還是用UV檢測器為佳，不需要使用其他檢測器測定。
5、在藥品的研制過(guò)程中(包括新藥的臨床前申報)，作為研究單位，只要你用確實(shí)可靠的方法確定了你的標準品的含量就可以了。等到藥品被批準上市的話(huà)，你提供標準品中檢所會(huì )測定含量的。最后的含量還是由中檢所確定的?；旧舷裆狭蟹椒y定標準品的含量是可以滿(mǎn)足申報新藥的要求的。
也許是我接觸的新藥研發(fā)比較少，完美的標準品標定在新藥研究中(比較嚴格的研究所我就不了解了)是很少那樣做的，基本就是像上面說(shuō)的那個(gè)化藥室的主任所說(shuō)的，大家一般都是只要你法定機構說(shuō)了這樣做可以那就決不愿意多做工作的，呵呵，反正我是這個(gè)樣子。最后法定標準品的含量是要由中檢所給出的，不是你申報單位說(shuō)了算。我想您說(shuō)的化藥一般絕不會(huì )用歸一化法來(lái)測含量可能意思是指的一般質(zhì)量標準中的含量測定，那是不能用歸一法。但標準品的標定和含量測定應該是兩個(gè)不同的概念。我以前做植化分離得到的單體給純度時(shí)，也一般就是只用歸一法，只是用不同的色譜條件、不同色譜柱等。
化藥標準品的含量測定首選還是化學(xué)法，根據化藥本身的性質(zhì)選方法，是非水滴定、酸堿滴定、電位滴定還是其他。你雖然做的是一類(lèi)藥，但基本的大類(lèi)你自己應該比較清楚的，參考同類(lèi)產(chǎn)品的原料含量測定的方法進(jìn)行方法學(xué)的摸索，只要你化學(xué)物的性質(zhì)分析清楚了，應該不是什么問(wèn)題。
原料含量測定是化學(xué)法?，F在大家儀器用慣了，總喜歡一開(kāi)始就用HPLC法。其實(shí)大家看看新藥研究指南中的內容，原料藥首選是化學(xué)法的。只有在化學(xué)法不能的情況下才用HPLC。要用HPLC就要用到標準品。你本來(lái)就是要做化藥標準品的含量測定，當然是要用化學(xué)法。
藥檢所的答案也是很官方的。因為你也許也能通過(guò)。但是為什么不去自己找一個(gè)好的化學(xué)法去做含量測定的方法呢。制劑才首選液相方法。你可以用化學(xué)法測定自己提純好的原料藥做標準品?！ ?/span>
標化應該不是測定含量的問(wèn)題，測定含量的前提就是有對照品，沒(méi)有對照品的情況下如何保證測定的準確性?如何進(jìn)行方法評價(jià)?
標化的過(guò)程應該是雜質(zhì)測定的過(guò)程，主要包括(1)HPLC色譜雜質(zhì)，(2)水分，(3)無(wú)機鹽，(4)殘留溶劑;除去所有雜質(zhì)的量即可得到對照品的純度。前面提到的方法在國內盡管可用，但不能稱(chēng)其為標化。
一個(gè)新藥在制定標準品的時(shí)候，往往已經(jīng)有了該新藥的質(zhì)量標準草案。那么，該標準品應首先按照該質(zhì)量標準做一下全面的質(zhì)量檢查(用到對照品的項目除外);如果該對照品的精制過(guò)程不同于藥物的精制工藝，則應針對該精制過(guò)程做相應的化學(xué)檢查。一般的化學(xué)雜質(zhì)應很低。
使用HPLC做純度分析是必須的，如果不適用，則至少應借助TLC分析其純度。均應選取完全不同的流動(dòng)相，證明其雜質(zhì)是被分開(kāi)的。HPLC應用二極管檢測器測定主峰的純度，若懷疑有UV不能檢測的雜質(zhì)，則應再選用其他檢測器測試一下。
如果純度很高，則可以采用面積歸一化法定量。如果有較大雜質(zhì)，應確定較大雜質(zhì)的性質(zhì)及相對響應因子，也可以通過(guò)確定最大雜質(zhì)的量來(lái)確定主含量。測定的結果應當與另外一種方法如化學(xué)法比對，以驗證其正確性。
首先要明白什么叫標化。利用基準物質(zhì)(或用已知準確濃度的溶液)來(lái)確定標準溶液濃度的操作過(guò)程，稱(chēng)為“標定”或稱(chēng)“標化”。標準物質(zhì)的標化雖然沒(méi)有嚴格的定義，但其基本意義應該是一致的，如果不知道一個(gè)已知含量如何確定未知含量。
使用UV檢測器可以看做是將分離開(kāi)(是否真正分離開(kāi)恐怕DAD的峰純度檢測也無(wú)法說(shuō)明)的物質(zhì)使用分光光度法測定其吸收度，在沒(méi)有確定含量的基準物時(shí)很難得知被標定物的含量。至于歸一化法，如果不是使用通用型檢測器(蒸發(fā)光，MS)光靠一個(gè)UV(包括DAD)首先很難選定測定波長(cháng)，如果人為因素參預其中，那就不是一個(gè)誤差可以形容的了;其次流動(dòng)相的選擇，比如甲醇：水，和甲醇：水(緩沖鹽)，在這里加入緩沖鹽其造成流動(dòng)相洗脫能力差異有多大，是否如 TLC 中使用三種不同極性的展開(kāi)劑進(jìn)行實(shí)驗那么有說(shuō)服力。
選用三種方法測定后取其平均值，其統計學(xué)意義何在。三種方法的誤差來(lái)源不同，用三個(gè)方法分別測定6次，再取其平均值，是否還需要考察方法的耐用性，不同的人不同天里用不同的方法測定后進(jìn)行t檢驗，總之想起來(lái)頭都痛了。
個(gè)人認為首先選取一種化學(xué)分析法測定其含量，再用HPLC偶聯(lián)通用型檢測器歸一化法測定，或者采用內標法測定含量(內標不好選，但也不是不能選)，對這幾組數據進(jìn)行方差分析，判定其是否有差異，也許是一個(gè)辦法。
根據本人經(jīng)驗，建議可以在工作的基礎上嘗試NMR定量法。最常用的HPLC法終歸只是面積歸一化，是相對含量，對于沒(méi)有紫外吸收的雜質(zhì)難以檢測。而 NMR可以做到絕對定量，有多少定量質(zhì)子信號就對應相應的純物質(zhì)量。我做過(guò)此方面的研究，比較可行，但需根據你化合物的結構選擇合適的定量?jì)葮撕腿軇?、適宜的樣品濃度、適宜的一組或幾組定量質(zhì)子、多次采樣、多次積分、優(yōu)化馳豫時(shí)間等，只是需要做方法學(xué)的考察。
